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分子生物学技术在动植物病原体的检测中的应用

来源:原创论文网 添加时间:2019-05-15

  摘要:在分子生物学技术日新月异的今天, 其应用也愈加广泛。本文重点对分子生物学技术在病原体检测和动物生态学领域的应用进行了综述, 同时阐述了常用的分子诊断技术和分子遗传学技术。

  关键词:分子诊断技术; 分子遗传学技术; 应用;

  随着时代的飞速发展, 分子生物学领域也突飞猛进, 许多新的研究手段和技术应运而生。这些手段和技术在生物学的各个领域都有着广泛的应用。

动物学论文

  一 分子生物学技术在动植物病原体的检测中的应用

  近年来, 随着分子生物学手段和技术愈发广泛和深入的使用, 使得疾病检测的技术在水产养殖中的应用有了迅猛进展, 这很大程度上提高了水产养殖病害诊断水平, 使得检测各种病原微生物更为安全、方便、快捷。分子诊断技术基于每种病原体都含有特异性的DNA或RNA序列, 通过对病原体核酸分子的鉴定来证实病原体, 该技术能有效地把病原体鉴定到亚种, 从而具体很高的应用价值。

  二 分子生物学技术在动物生态学领域里的应用

  分子生物学相关的技术和手段已在动物生态学领域广泛应用, 且取得了很好的结果。其相关应用在主要在以下几个领域:

  (一) 系统发生

  系统发生主要包括如下两个方面:一是了解物种之间的种群进化关系;二是辨别灭绝的物种。如今, mt DNA已成为其主要资料来源。

  (二) 迁移和基因漂移

  迁移是指具有某一基因频率的一部分种群, 迁移至基因频率不同的另一种群, 杂交并定居, 从而改变了种群的基因频率, 它是重要的种群结构的内容。而基因漂移则是由于某一种目标基因自发的进行转移, 使附近的近缘物种受到影响从而发生基因的改变, 最终生成一种新的具有目标基因优势特征的物种。

  (三) 交配制度

  对交配制度的研究可以衡量在自然状态下个体的繁殖成功。主要研究手段是多基因位点指纹法、单基因位点指纹法、RFLP分析法。

  (四) 性别确定

  性别是由特定的DNA决定的, 是单基因位点上的等位差异, 这种差异包含性染色体。现如今根据人类性别决定主要取决于Y染色体上的性别决定区域, 我们就可以运用分子生物学技术 (如做探针) 来对哺乳动物进行性别的鉴定。

  三分子诊断技术

  分子诊断技术目前主要包括探针杂交、核苷酸测序、PCR (聚合酶链式反应) 、和限制性酶切等, 其中PCR和核酸杂交技术是病害检测中最常用的两个方法。

  (一) PCR检测技术

  PCR检测技术包括常规定性PCR检测方法、荧光定量PCR技术和PCR-ELISA技术等;

  PCR技术又称DNA体外扩增技术。使用PCR来进行疾病诊断具有很多传统诊断方法所不具备的优点, 如操作更加简单便捷, 大大缩短了诊断时间;由于PCR技术的特异性强, 这也使得诊断的正确性有了保证。

  1. 常规定性PCR检测方法

  基于特定的情况设计引物, 然后进行PCR, 将得到的产物使用电泳来检验是否成功得到特定的条带, PCR扩增产物的有或无即可显示样品是否被特定的病原体感染。以上即是使用常规定性PCR检测方法进行疾病诊断的基本步骤。

  2. 荧光定量PCR技术

  荧光定量PCR技术是传统PCR技术的突破, 与常规性的PCR技术相比, 荧光定量PCR技术又实现了一次飞跃。该技术可以对DNA或RNA样品进行定量和定性分析, 其中定量分析又包括绝对定量分析和相对定量分析;此外荧光定量PCR技术还可以对PCR产物进行定性分析。基于上述几点, 荧光定量PCR技术在临床患病动物的治疗效果观察及指导用药方面具有重大意义, 该技术现已广泛应用于临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。

  3. PCR-ELISA技术

  PCR-ELISA技术是传统PCR技术与ELISA技术 (酶联免疫吸附) 的结合, 该技术方便快捷, 有PCR仪和酶标仪即可完成, 对仪器的要求相对较低, 在特异性和灵敏度等方面均有很大的提高, 因而在临床具有一定的应用价值。PCR-ELISA技术主要包括三个部分:聚合酶链式反应 (PCR) 、产物与探针的杂交及ELISA酶标显色, 即在PCR之后利用酶联免疫吸附试验的原理, 使用酶标抗体, 通过液相或杂固相杂交实现定量检测。该技术如今已经被广泛的应用于病原微生物的检测中, 但由于酶联免疫吸附技术存在的一些假阳性或污染等问题使得该技术在病原微生物诊断中的应用受到限制。

  (二) 核酸杂交检测技术

  核酸杂交是被广泛应用于基因诊断及遗传学研究, 它是一项基本的分子生物学技术, 原理即核酸分子的碱基具有互补性。核酸杂交的形式有多种, 常用的是Southern杂交、Northern杂交和原位杂交等, 已标记的核酸探针可用来检测待测核酸样品中特定基因序列。根据探针的来源和性质不同又可分为DNA探针, RNA探针, c DNA探针, c RNA探针及寡核苷酸探针等几类, 其中DNA探针还有单链和双链之分。基因探针标记物根据标记方法不同可分为放射性和非放射性探针标记物两大类, 由于放射性探针标记物的灵敏度和特异性极高, 因此它是应用最多的一类核酸探针标记物, 可检测出样品中少于1000个分子的核酸含量。

  (三) 限制性酶消化技术

  限制性酶消化技术包括限制性片段长度多态性分析、随机扩增多态性DNA技术、扩增性片段长度多态性技术等。

  1. 限制性片段长度多态性分析

  PCR-RFLP技术 (RFLP) 即聚合酶链式反应—限制性片段长度多态分析技术, 该技术是在传统的PCR技术基础上发展起来的。首先采用PCR扩增出包含碱基置换的一段DNA, 该段DNA经某一限制性内切酶切割成确定的片段, 再利用琼脂糖凝胶电泳分离产物, 通过比较来确定是否变异。限制性片段长度多态性分析能很好地检测出某段DNA在酶切后得到的产物的大小, 灵敏度很高。使用PCR-RFLP技术可以对近缘的病原体进行鉴定, 还可对于致病基因的突变进行检测。

  2. 随机扩增多态性DNA技术

  随机扩增多态性DNA技术即为RAPD, 该技术采用一系列随机的引物对所研究的基因组进行PCR扩增, 产物经过电泳检测, 进而对DNA的多态性进行检测。DNA具有多态性即可能是由于碱基发生突变、缺失或插入等原因。该方法建立在传统PCR技术的基础上, 不需要专门设计引物, 操作简单快捷, 检测效率高, 样品用量少, 但采用RAPD技术分析稳定性比较差。

  3. 扩增性片段长度多态性技术

  扩增性片段长度多态性技术即AFLP技术, 该技术结合了传统PCR技术和RFLP的特点, 从而更加高效和可靠, 此外它操作简单快捷, 因而被广泛应用于生物学领域。扩增AFLP技术实质就是将经过两种或两种以上的限制性内切酶切割所形成的片段末端与双链接头连接。

  四常用的分子遗传学技术

  (一) DNA指纹技术

  DNA指纹技术 (DNA fingerprinting) 的基础是小卫星DNA (minisatellite DNA) , 小卫星DNA是基因组中的高变区。Jeffreys等 (1985) 发现小卫星DNA都含有一段相同的核心序列 (虽然其重复单位的长度和序列不完全相同) , 若把核心序列串联起来作为分子探针, 与不同个体的DNA进行分子杂交, 就会形成特有的杂交图谱, 不同个体的杂交图谱均有很大的不同。由于这种杂交图谱与人的指纹一样具有高度的特异性, 因而被称作DNA指纹技术。

  (二) DNA—DNA杂交

  核酸杂交是分子生物学的一项基本技术, 都是基于核酸的碱基互补配对原理。核酸杂交有多种形式, 从杂交材料可分为DNA-DNA杂交、RNA-RNA杂交和DNA-RNA杂交。DNA—DNA杂交技术是最常用的的一种分子遗传学技术, 其简单形式之一就是将DNA点印并固定于滤膜上, 然后将探针加以标记 (采用放射性或者非放射性标记法) 。

  五展望

  现如今, 分子生物学技术在动物疫病的诊断、预防和治疗技术方面扮演着至关重要的角色, 例如可以运用分子生物学技术生产相关药物或者核酸疫苗, 对一些疾病进行快速准确地诊断, 培育转基因动物等。相信随着分子生物学技术的不断深入发展, 其应用将会愈来愈广泛。

  参考文献
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