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鸡白痢沙门氏菌的的分离和药敏试验

来源:原创论文网 添加时间:2019-10-10

  摘    要: 本研究采集了某鸡场疑似感染鸡白痢的病死鸡组织,进行了沙门氏菌的分离、鉴定,以及对10种常见抗生素的药物敏感性试验。结果显示:分离株均为鸡白痢沙门氏菌,对阿米卡星(0%)、庆大霉素(0%)、头孢噻肟(3.70%)的耐药率较低,对链霉素(88.89%)、四环素(62.96%)、阿莫西林(51.85%)的耐药率较高,且分离株至少可对1种药物产生耐药性,至多可对5种药物产生耐药性,70.37%的菌株可耐3种以上药物,其中耐3种药物的菌株数量最多(48.15%)。该研究结果可对临床合理用药提供指导,也为该地区鸡白痢的耐药性监测提供依据。

  关键词: 鸡白痢沙门氏菌; 分离; 鉴定; 耐药性;

  Abstract: The isolates of Salmonella Pullorum were isolated and identified from the suspect samples of the illness or dead chickens in a chicken farm, and their antimicrobial resistances to 10 common antibiotics were analysed by drug sensitivity test. The results showed that all the isolates were Salmonella Pullorum. The rates of antimicrobial resistance to amikacin (0%), gentamicin (0%) and cefotaxime (3.70%) were lower, yet the ones to streptomycin (88.89%), tetracycline (62.96%) and amoxicillin (51.85%) were higher. The Salmonella Pullorum isolates were resistant to 1 antibiotic at least, and 5 antibiotics at most. 70.37% isolates were resistant to 3 or more antibiotics, and the proportion of isolates resistant to 3 antibiotics was the highest (48.15%). The results of this study can provide guidance for rational drug use in clinic and a basis for monitoring the resistance of Salmonella Pullorum in this area.

  Keyword: Salmonella Pullorum; isolation; identification; antimicrobial resistance;

  鸡白痢沙门氏菌(Salmonella Pullorum)为肠杆菌科沙门氏菌属成员,是一类在鸡场中较为常见的重要病原菌[1,2],可引起雏鸡的下痢、急性败血症等,死亡率较高,成年鸡则主要呈现慢性感染或隐形感染,可长期带毒且经卵垂直传播,给鸡场带来了巨大的经济损失[3,4,5]。目前使用抗生素进行治疗仍是防治鸡白痢的重要措施之一,但由于抗生素的长期使用甚至是不合理使用,使得沙门氏菌产生了广泛而严重的耐药性[6,7,8,9],因此加强鸡场中病原菌的耐药性监测对于细菌病的防治至关重要。

  本研究采集某鸡场疑似感染鸡白痢的病死鸡组织,进行沙门氏菌的分离、鉴定及药物敏感性试验,根据药敏试验结果,为该鸡场合理用药提供指导,也为该地区鸡白痢的综合防控及耐药性监测提供依据。

  1 、材料与方法

  1.1 、样品采集

  选取某鸡场临床症状与病理变化疑似鸡白痢的病死鸡32 只,采集病死鸡的肝脏与心脏等组织作为待检病料。
 

鸡白痢沙门氏菌的的分离和药敏试验
 

  1.2、 试剂

  麦康凯琼脂、LB培养基、革兰氏染色试剂盒等购自青岛海博生物技术有限公司。细菌微量生化反应管(葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、阿拉伯糖、鼠李糖、甘露醇、卫矛醇、吲哚、硫化氢、枸橼酸盐)及药敏纸片(阿莫西林、恩诺沙星、环丙沙星、庆大霉素、阿米卡星、链霉素、头孢噻肟、头孢唑林、强力霉素、四环素)购自杭州天和微生物试剂有限公司。DL2000 DNA Marker、2×Taq PCR Master Mix购自宝生物工程(大连)有限公司。

  1.3、 细菌的分离培养

  无菌采集病死鸡的肝脏、心脏等组织样品接种于麦康凯琼脂平板上,37 ℃培养18~24 h,选取单个可疑菌落按常规作平板反复划线获得纯培养,挑取典型纯培养菌落置于LB培养基中振摇进行增菌培养,用于后续鉴定。

  1.4 、分离株的染色镜检

  挑取纯培养的可疑菌落制成涂片,按照革兰氏染色试剂盒说明书进行染色、镜检,观察菌株形态。

  1.5 、分离株的生化试验

  按照细菌微量生化反应管说明书,将纯培养菌株分别接种至各生化管中,经37 ℃培养24~48 h观察结果。

  1.6 、鸡白痢沙门氏菌的PCR鉴定

  根据参考文献[10],合成鸡白痢沙门氏菌的血清型特异性PCR检测引物,上游引物:5’- CGATAATGGCAACCGCACTG -3’,下游引物:5’- TGATGTCTGCCCCTTTCGAC -3’,扩增产物大小为356bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

  取200 μL待检菌液采用煮沸裂解法提取基因组DNA,以此为模板进行PCR鉴定,同时以灭菌去离子水为阴性对照。PCR反应体系为25 μL,其中各组分为:模板1 μL,2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,加灭菌去离子水补足至25 μL。PCR反应程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s,30个循环;72 ℃延伸7 min。根据1%的琼脂糖凝胶电泳结果,判定分离株血清型。

  1.7 、分离株的药敏试验

  以大肠埃希氏菌ATCC25922为药敏质控菌株,采用K-B纸片扩散法进行分离株的药敏试验[11]。将分离株24 h纯培养菌液用无菌生理盐水配置成0.5麦氏单位,均匀涂布于LB琼脂平板上,贴上药敏纸片置于37 ℃培养18~24 h,测量抑菌圈直径,判定分离株对10种常用抗生素的耐药情况[12]。

  2 、结果与讨论

  2.1、 菌株的初步分离与镜检

  病死鸡组织中分离的可疑菌株在麦康凯琼脂平板上形成圆形、光滑、白色或无色的细小菌落,将菌落反复纯化培养,共获得27株可疑菌株培养物,经革兰氏染色镜检均为短小、两头钝圆的革兰氏阴性杆菌,多为分散存在,符合沙门氏菌的菌落特征。

  2.2、 生化试验

  将27株纯培养的可疑菌株接种至微量生化反应管中,37 ℃培养24~48 h后,分离株的生化试验结果一致(表1),均能发酵葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、甘露醇、卫矛醇,不发酵乳糖、蔗糖、麦芽糖,不产生吲哚、硫化氢,不利用枸橼酸盐,符合鸡白痢沙门氏菌的生化特性。

  表1分离株的生化特性
表1分离株的生化特性

  注:+表示反应为阳性,-表示反应为阴性“+” indicates positive reaction; “-” indicates negative reaction

  2.3、 菌株血清型的PCR鉴定

  用鸡白痢沙门氏菌特异性引物进行PCR检测,27株可疑菌株均可扩增出356 bp的目的条带(图1),证明分离所得的菌株均为鸡白痢沙门氏菌。

  图1部分分离株PCR鉴定结果
图1部分分离株PCR鉴定结果

  Fig.1 Identification results of partial isolates by PCR

  M:DNA 分子量标准;1:阴性对照;2-9:部分分离菌株M: DL2000 DNA Marker; 1: Negative control; 2-9: Some isolates

  2.4、 药敏试验

  对27 株鸡白痢沙门氏菌分离株进行了10 种常用抗生素的敏感性试验,结果显示:分离株除了对阿米卡星和庆大霉素的敏感率达100%以外,对于其他8 种药物均有不同程度的耐药情况,耐药率由高到低分别为:链霉素(88.89%)、四环素(62.96%)、阿莫西林(51.85%)、强力霉素(37.04%)、头孢唑林(29.63%)、恩诺沙星(14.81%)、环丙沙星(7.41%)、头孢噻肟(3.70%)(表2)。

  表2鸡白痢沙门氏菌分离株的药敏试验结果
表2鸡白痢沙门氏菌分离株的药敏试验结果

  沙门氏菌分离株的多重耐药情况也十分严重,所有分离株至少可耐一种药物,70.37%(19/27)的菌株可耐三种以上药物,其中三耐菌株数量最多,达48.15%(13/27),而7.41%(2/27)的菌株最多可耐五种药物(图2)。这些严重的多重耐药情况将造成疾病防治难度的增大。

  图2鸡白痢沙门氏菌分离株的多重耐药情况
图2鸡白痢沙门氏菌分离株的多重耐药情况

  Fig.2 Multi-drug resistance of Salmonella Pullorum isolates

  根据本研究中的药敏试验结果,建议该鸡场选取阿米卡星、庆大霉素、头孢噻肟等高敏药物进行鸡白痢的防治工作,并在治疗过程中采用交叉用药、轮换用药等方式,以达到较好的疗效,降低耐药菌株产生的可能性[13]。同时,加强鸡场的饲养管理水平,建立生物安全体系,定期对环境及器械等进行消毒,从而消除致病菌的增殖与传播,保证鸡群的健康养殖。

  参考文献

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