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基因组重排原理和具体方法

来源:原创论文网 添加时间:2019-11-13

  摘    要: 基因组重排技术是21世纪初发展起来的基于全基因组的定向微生物菌种改良技术.本文介绍了基因组重排技术的原理,并重点概述了基因组重排的具体过程,最后对基因组重排技术的发展进行了展望.

  关键词: 基因组重排; 递推; 原生质体融合; 育种;

  基因组重排技术(genome shuffling)是一种基于整个微生物基因组重排的定向菌种改良技术,2002年,Zhang首先提出基因组重排这一概念:它无须提前知道菌株的代谢途径及基因表达调控机制等遗传背景,直接对微生物进行全基因组重排[1],现在已被视为一种有效的微生物育种方法.

  1、 基因组重排原理

  基因组重排是在传统诱变育种获得突变株后,通过递推式原生质体融合技术,对突变株的原生质体进行基因组重排,将正突变的基因集中在一起,从而大大提升菌株的正向突变的频率及突变的速率.基因组重排技术一般被用于改良甚至改造微生物的基因,从而获得性状更加优良的表型.基因组重排技术与经典的杂交育种技术不同之处在于,后者在每次重排时只有两个亲本,然而基因组重排技术却是两个以上的多亲本杂交,并且通过反复的递推式杂交,从而产生很多表型改良显着的新突变株[1,2,3].

  2、 基因组重排具体方法

  基因组重排技术通过模拟自然进化过程,将突变菌库中的带有不同遗传性状的正变菌株基因进行多亲本融合,在全基因组范围内随机交换基因,通过筛选,剔除基因组中的不利的变异基因,在递推式融合中,将突变菌株库中的有利基因逐渐积累,从而完成跳跃性人工进化.基因组重排育种技术主要分五步:

  2.1、 突变菌株库的建立

  基因组重排育种技术首先会构建一个包含不同遗传特性的突变菌株库,其中的亲本拥有多种多样的基因,在后续的递推式原生质体融合时,不同的优良性状可以进行剪接,然后统一集中到融合体中.通常,突变菌株库可借助自然分离、诱变育种等常见技术建立,从而获得更多带有多样性基因的亲本.
 

基因组重排原理和具体方法
 

  2.2 、亲本的筛选

  当利用诱变育种技术进行微生物菌种选育时,“选”与“育”要结合起来,提高诱变效率.首先进行“育”:通过各种诱变手段(如物理诱变、化学诱变等),使菌株产生基因型突变,但该突变是不定向的,只有极少部分是正突变;再进行“选”:借助各种筛选方法筛选出具有某特定表型的突变株,如能够耐受不良环境(如某种浓度的抗生素、前体或不同的pH等),从绝大部分的负突变中快速筛选出正突变,进一步提高筛选效率.

  2.3 、亲本原生质体的制备

  原生质体融合技术是基因组重排技术的基础,又很多因素会直接影响原生质体制备及再生效果,如微生物的菌龄、制备原生质体的酶种类及浓度、酶解温度及时间、缓冲液及再生培养基的成分与设计等.李亮等[4]在利用基因组重排技术选育红曲霉菌SH2-7生产治疗心血管良药的洛伐他汀时对原生质体制备及再生条件进行了考察,结果表明,当溶壁酶为1.0%,菌丝菌龄为66h,在酶解温度为30℃下酶解3h,采用pH为6.0的高渗磷酸盐缓冲液,0.6mo/L的NaCl作为再生培养基的渗透压稳定剂时,原生质体再生率高达1.45%.

  2.4 、原生质体递推式融合

  基因组重排技术是基于原生质体融合技术的多轮递推式融合[5],此种方式的融合不仅能提高不同遗传特征细胞之间的基因频率,还能进一步提高基因组重排的高效性.第一轮融合后,筛选出若干株性状比较优良的菌株作为亲本,按照相同的操作方法进行第二轮融合.根据研究人员的原始意图和融合子最终显示的特性,可以实施若干轮融合.

  原生质体融合的方法主要包括化学法及电诱导融合等方法.化学法是利用聚乙二醇促进融合,如Zhang等[6]建立了一种优化的聚乙二醇介导的原生质体转化系统,用于黑曲霉ATCC 20611高效生产低聚果糖.电诱导融合法是基于电学和生物化学的理论.在电场作用下,原生质体向电极方向泳动,同时,在细胞内产生偶极化,以促进原生质体的粘附,最终使原生质体在短时间内发生融合.Ye等[7]为了让苹果酒更富有风味和香气,对酿酒酵母和克鲁氏假丝酵母的灭活原生质体进行电诱导融合,最终获得一株感官评分和香气成分含量得分最高的杂交R4.

  2.5、 融合子的筛选

  融合子的检出和鉴定在基因组重排中占据非常重要的地位.通常可依据基因组重排的目的进行重组子的筛选,可借助菌株对环境的不同耐受力,或设计一些选择性培养基来实现.Wang等[8]以分离到的Lactobacillus plantarum IMAU10014及Lactobacillus helveticus IMAU40097为材料,以Penicillium digitatum KM08模式菌为指示菌,通过基因组重排技术提高乳酸菌抗真菌活性.Gérando[9]等利用随机诱变及基因组重排技术,提高了厌氧菌Clostridium beijerinckii DSM溶剂耐受性及异丙醇/丁醇/乙醇的产量,极大改善自然异丙醇产生菌的表型.

  另外,还可通过灭活法来筛选重组体.如Yin等[10]为了提高酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae YS86产谷胱甘肽的产量,利用紫外照射和加热处理获得致死的原生质体,并对其进行两轮基因组重排,最终获得高产的重组子YSF2-19,其在摇瓶和发酵罐中谷胱甘肽产量分别增加了3.2及3.3倍笔者[11]利用紫外线照射及加热灭活处理Streptomyces virginiae原生质体,在链霉素抗性压力下,并对其进行五轮基因组重排,最终获得一株维吉尼亚霉素产量稳定的重组子G5-103,产量约为251mg/L,比亲本UV-1150及野生株提高3.1及11.6倍.

  3、 基因组重排技术存的问题与展望

  目前,基因组重排技术面临很多瓶颈,其中融合子的高通量筛选是最难攻克的环节,现尚无快速高效的筛选方法,需要研究者借助已有知识及技术深入挖掘.另外,由于跨种属亲本之间同源性较差,重组概率较低,因此基因组重排技术很少用于不同种亲本的融合.

  基因组重排技术自2002年问世以来便受到人们的广泛关注,并应用在各种微生物菌种改良中,取得了巨大的经济及社会效益.随着自身技术的发展及生物信息学、蛋白质组学等生物技术的成熟,基因组重排技术必然成为日后开发新产品、新物种的有力技术,为加速微生物菌种改良,进一步促进产业化做出贡献.

  参考文献

  [1]Zhang Y X.,Perry K.,Vinci V A.,et al.Genome shuffling leads to rapid phenotypic improvement in bacteria[J].Nature,2002,415(6872):644-646.
  [2] Powell K A.,Ramer S W.,Stephen B.,et al.Directed Evolution and Biocatalysis[J].Angewandte Chemie International Edition,2001,40(21):3948-3959.
  [3] Stemmer W P C.Molecular Breeding of Genes,Pathways and Genomes by Dna Shuffling[J].Biotechnology&Bioprocess Engineering,2002,7(3):121-129.
  [4] 李亮,林娟,叶秀云.利用基因组重排技术选育高产洛伐他汀红曲菌株[J].福州大学学报(自然科学版),2017(5):754-760.
  [5] 仝倩倩.高通量筛选及基因组重排选育维吉尼亚霉素高产菌[D].2018.
  [6] Zhang J.,Liu C.,Xie Y.,et al.Enhancing fructooligosaccharides production by genetic improvement of the industrial fungus Aspergillus niger ATCC 20611[J].Journal of Biotechnology,2017,249:25-33.
  [7] Ye M.,Yue T.,Yuan Y.,et al.Production of yeast hybrids for improvement of cider by protoplast electrofusion[J].Biochemical Engineering Journal,2013,81:162-169.
  [8]Wang H K.,Sun Y.,Chen C.,et al.Genome shuffling of Lactobacillus plantarum for improving antifungal activity[J].Food Control,2013,32(2):341-347.
  [9]Gérando H.,Mátéde.,Fayolle-Guichard F.,et al.Improving isopropanol tolerance and production of Clostridium beijerinckii DSM6423 by random mutagenesis and genome shuffling[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2016,100(12):5427-5436.
  [10] Yin H.,Ma Y.,Deng Y.,et al.Genome shuffling of Saccharomyces cerevisiae for enhanced glutathione yield and relative gene expression analysis using fluorescent quantitation reverse transcription polymerase chain reaction[J].Journal of Microbiological Methods,2016,127:188-192.
  [11]Tong Q Q.,Zhou Y H.,Chen X S.,et al.Genome shuffling and ribosome engineering of Streptomyces virginiae for improved virginiamycin production[J].Bioprocess&Biosystems Engineering,2018(41):729-738.

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