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猪鼻腔黏膜中菌群种类与特征分析

作者:原创论文网 时间:2018-10-08 12:24 加入收藏

猪鼻腔黏膜中菌群种类与特征分析摘要

  Characteristics and identification of bacterial floras inhabiting in the nasal cavity of pigs

  
  Abstract:Nasal associated lymphoid tissue (NALT) is the main induction site in the nasal mucosa, and the bacterial floras inhabiting in the nasal cavity can influence the immune effects of nasal vaccines. In this study, 49 bacterial strains from NALT of 15 pigs were isolated, which were identified by amplification of the 16S rDNA genes using PCR and sequence analysis. The results showed that Escherichia coli was the dominant bacteria in NALT, with a detection rate of 86. 67%, Bacillus subtilis was less dominant, with a detection rate of 80. 00%, and Proteus mirabilis and Bacillus cereus were the least dominant, with detection rates of 73. 33% and 26. 67%, respectively. Of the 40 bacterial strains from nasal vestibule, Bacillus subtilis had a detection rate of 80. 00%; Escherichia coli, of 80. 00%; Proteus mirabilis, of 66. 67%;Bacillus cereus, of 13. 33%; and Staphylococcus saprophyticus, of 6. 67%. The above results indicated that Escherichia coli was the dominant bacteria in the nasal cavity of pigs, and Bacillus subtilis and Proteus mirabilis existed there in large quantities.
  
  Keyword:pigs; nasal cavity; bacterial flora;
  
  鼻腔黏膜是呼吸道病原进入机体组织的第一道屏障[1].鼻腔是呼吸道最先与外界接触的部位, 大量病原微生物通过鼻腔进入呼吸道入侵机体。鼻腔免疫可以诱导呼吸道局部免疫反应, 同时可以引起全身免疫应答。鼻腔免疫是非侵入性的, 易于操作, 可以快速吸收抗原, 从而防止呼吸道感染[2].鼻腔黏膜下分布有大量的淋巴组织 (nasal-associated lymphoid tissue, NALT) , 在防御病原微生物入侵中发挥重要的作用[3].NALT中分布有大量T细胞和B细胞, 同时散在分布许多树突状细胞 (dendritic cells, DCs) .NALT的滤泡相关上皮 (follicle-associated epithelium, FAE) 中存在散在M细胞, M细胞通过转胞吞选择性地将抗原转移给NALT中的抗原呈递细胞 (antigenpresenting cells, APCs) [4].DCs是NALT中的专职APCs, 它可以将抗原递呈给T细胞, 进一步诱导免疫应答[5].由于NALT在鼻腔免疫的抗原识别和免疫激活中起着重要的作用, 因此它被认为是免疫的主要诱导和效应位点。
  
  鼻腔中存在大量微生物, 在一定程度上影响鼻腔疫苗免疫效果[6-7].目前关于肠道菌群的构成已经有报道, 但是关于猪鼻腔黏膜中菌群种类至今未见报道。本研究对猪鼻腔中的菌群特点进行初步探讨。
  
  1、材料与方法
  
  1.1 试验动物
  
  试验所用猪有2种:30日龄淮猪 (编号1-5) , 饲养于江苏省淮安养猪厂;30日龄长白猪 (编号6-15) , 饲养于江苏省农业科学院。可自由采食和饮水, 食用饲料不含有抗生素和微生物类添加剂。
  
  1.2 主要试剂
  
  细菌基因组DNA提取试剂盒, 购自北京天根生化科技有限公司;DNA凝胶回收试剂盒, 购自上海碧云天生物技术有限公司。
  
  1.3 样品采集
  
  1.3.1 采集方法
  
  试验前禁食1 d, 提供正常饮水。称取试验猪只体重, 静脉注射戊巴比妥钠 (100 mg/kg) , 待猪麻醉后断颈法处死, 剔除鼻腔周围的皮肤及肌肉, 取鼻腔, 放入无菌生理盐水中。
  
  1.3.2 样品处理
  
  超净台中将鼻腔放入无菌生理盐水中涮洗, 剥离鼻腔前部鼻前庭黏膜和鼻腔后部有NALT处的黏膜。将组织分别放入1 m L的PBS中, 用匀浆器 (瑞士Polytron PT1200CL) 制成匀浆, 离心以除去组织碎片, 500 r/min离心10 min.收集上清液, 用无菌磷酸盐缓冲液 (PBS, 0.01 mol/L, p H7.2) 释至适当浓度后备用。
  
  1.4 细菌分离纯化与培养
  
  取100μL组织上清稀释液涂板, 接种于血平板中, 37℃恒温箱倒置培养20 h.根据平板上菌落生长的形态、大小、颜色、气味、溶血性等进行分类。挑取每一类典型菌落接种于液体LB培养基中, 37℃恒温摇床培养过夜后, 划线接种于固体LB培养基上, 37℃恒温箱倒置培养20 h, 直至长出单菌落并进行革兰染色镜检, 初步区分革兰阴性和阳性菌。
  
  为了说明鼻腔中的细菌已被清洗干净, 同时取100μL最后一次组织涮洗液, 以相同的方法进行涂板培养, 以无细菌生长为准。
  
  1.5 分子生物学鉴定
  
  分离纯化细菌后, 应用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA (操作步骤依据说明书) .
  
  利用细菌通用引物 (上游引物:5'-AGA GTT TGA TCG TGG CTCA-3';下游引物:5'-TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3') 扩增16S r DNA基因片段, 预期扩增的目的片段长度为1 500 bp.
  
  反应体系:2μL模板DNA, 25μL Mix, 2μL Primer F (上游引物) , 2μL Primer R (下游引物) , dd H2O补足50μL.
  
  PCR反应条件:94℃预变性5 min;94℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸1.5 min, 30个循环;72℃延伸10 min.
  
  反应结束后取5μL扩增产物, 用1.0%琼脂糖凝胶 (含0.5μg/m L溴化乙钉) 电泳检测PCR产物。在紫外灯下观察, 用数字凝胶成像系统记录试验结果。将阳性PCR扩增产物应送南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。
  
  1.6 16S r DNA基因同源性分析
  
  将分离菌株测序结果与Gen Bank中参考菌株16S r DNA基因核苷酸序列进行同源性比对分析。根据不同属细菌16S r DNA基因同源性为70%~90%, 而同一种内不同株间基因同源性大于99%的判定标准, 确定细菌种属。
  
  2、结果
  
  2.1 16S r DNA基因同源性分析
  
  对分离菌株的16S r DNA基因PCR扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳观察, 在1 500 bp处均出现符合大小的目的条带 (图1) .将PCR产物回收并测序, 并将测序结果与Gen Bank中参考菌株16S r DNA基因核苷酸序列进行同源性比对分析。
  

图1 16S r DNA基因PCR扩增结果

  
  2.2 细菌分离鉴定
  
  2.2.1 NALT黏膜处的菌群
  
  从15头试验猪的NALT中共分离得到49株细菌 (表1) .其中:大肠杆菌13株, 枯草芽胞杆菌12株, 奇异变形杆菌11株, 蜡样芽胞杆菌4株, 地衣芽胞杆菌2株, 表皮葡萄球菌2株, 腐生葡萄球菌、阪崎肠杆菌、克雷伯菌、弗氏柠檬酸杆菌、金黄色葡萄球菌各1株。15头猪NALT黏膜处分离菌株的检出数和检出率见表1.
  
  2.2.2 猪鼻前庭黏膜处的菌群
  
  从15头试验猪的鼻前庭黏膜中共分离得到40株细菌 (表2) .其中, 枯草芽胞杆菌12株, 大肠杆菌12株, 奇异变形杆菌10株, 蜡样芽胞杆菌2株, 腐生葡萄球菌、弧菌、绿脓杆菌、猪链球菌各1株。

表1 15头猪NALT黏膜处分离菌株的检出数和检出率

  

表2 15头猪鼻前庭黏膜处分离菌株的检出数和检出率

  
  2.2.3 NALT处和鼻前庭黏膜处菌群比较
  
  比较1号、2号、3号、11号、12号、13号、14号、15号猪NALT处和鼻前庭黏膜处细菌种类发现, NALT处和鼻前庭黏膜处的细菌种类和数量存在差异:其中, 大肠杆菌 (检出率分别为86.67%、80.00%) 、枯草芽胞杆菌 (检出率分别为73.33%、80.00%) 、奇异变形杆菌 (检出率分别为80.00%、66.67%) 、蜡样芽胞杆菌 (检出率分别为26.67%、13.33%) 、腐生葡萄球菌 (检出率均为6.67%) 为二者共有细菌;而地衣芽胞杆菌、表皮葡萄球菌、阪崎肠杆菌、克雷伯菌、弗氏柠檬酸杆菌、金黄色葡萄球菌 (检出率均为6.67%) 只存在于NALT中, 温和气单胞菌、绿脓杆菌、猪链球菌 (检出率均为6.67%) 只在鼻前庭黏膜中检测得到 (图2) .
  

图2 NALT处和鼻前庭黏膜中的菌群比较

  
  3、讨论
  
  鼻腔免疫不仅可以有效地诱导消化道黏膜免疫应答反应, 而且能够通过共同黏膜免疫系统同时加强全身免疫应答水平[8].目前猪呼吸道疾病已成为影响我国生猪大规模养殖的主要因素, 如伪狂犬病毒、猪流感等[9-11].鼻腔免疫猪圆环病毒2型 (PVC2) 疫苗, 可以增加抗体分泌细胞的数量, 能有效地减少临床症状[12].NALT位于呼吸道入口处, 是呼吸道抵御病原入侵的第一道防线[13].有研究表明, NALT在消化道免疫中发挥重要功能, 不仅表面分布着具有胞吞转运抗原功能的M细胞, 在固有层也分布有丰富的树突状细胞 (DCs) 、T细胞、和B细胞[14].可见, NALT是主要的鼻腔黏膜免疫诱导位点。因此, 设计合理的靶向NALT的鼻腔递送疫苗, 对于鼻腔黏膜免疫研究的突破具有潜在的价值。
  
  扁桃体作为黏膜相关淋巴组织是许多病原微生物藏身之处, 如猪链球菌2型 (SS2) [15]、人艾滋病毒1型 (HIV-1) [16]等。扁桃体中的DCs可以在无害抗体和共生菌之间发挥免疫调节的作用, 维持共生菌群之间的平衡[17].那么NALT是否也可作为病原微生物入侵机体的门户同样受到关注。研究发现一些病原菌可以通过NALT的M细胞入侵机体, 如人甲型流感病毒[18].而在本试验中, 鼻腔NALT处黏膜和鼻前庭黏膜中大肠杆菌的检出率最高, 分别为86.67%和80.00%.大肠杆菌是人类和动物正常菌群, 大部分位于肠道, 呼吸道中也有分布, 多不致病。本试验虽然发现鼻腔中存在大肠杆菌, 但由于未做攻毒试验, 尚不能确定分离菌株是否具有致病力。另外, 对于大肠杆菌在鼻腔中大量存在的具体原因有待研究。
  
  值得注意的是, 本试验中枯草芽胞杆菌在NALT中检出率较高, 仅次于大肠杆菌, 鼻前庭中枯草芽胞杆菌与大肠杆菌检出率都最高, 这可能是由于在土壤和空气中本就大量存在枯草芽胞杆菌[19], 而猪的行为学本能如拱土可能使这2种细菌在长期进化中逐渐具备了肠道固有益生菌的典型特点。作为兼性厌氧菌, 枯草芽胞杆菌的孢子可以迅速消耗鼻腔内游离的氧, 在鼻腔内停留一段时间[20].另外, 在NALT和鼻前庭处黏膜中也存在致病菌和条件致病菌, 如表皮葡萄球菌、阪崎肠杆菌、克雷伯菌、弗氏柠檬酸杆菌、金黄色葡萄球菌;鼻前庭处黏膜存在温和气单胞菌、绿脓杆菌、猪链球菌等, 但是检出率较低, 这可能与其相关免疫功能有关。综上所述, 大肠杆菌是鼻腔内的优势菌群, 枯草芽胞杆菌和奇异变形杆菌在猪鼻腔内大量存在。猪鼻腔内菌群特点及其鉴定为进一步研究猪的鼻腔免疫奠定基础。
  
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