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不同鼠李糖乳杆菌在不同碳源下的生长特性

来源:原创论文网 添加时间:2019-05-09

  1、引言

  2001 年, FAO/WHO 联合将益生菌定义为“摄入足够数量后, 对宿主健康提供益处的活的微生物”[1], 被广泛应用的益生菌有乳杆菌、肠球菌和双歧杆菌等[2]。鼠李糖乳杆菌有较高的细胞黏附能力, 可以增强免疫防御、缓解急性腹泻、降低血脂、预防龋齿和小儿湿疹、减少呼吸道感染以及改善克罗恩病症状等[3-8], 是研究和应用最为广泛的乳杆菌。而益生菌赋予的健康益处是菌株特异性的[9], 所以在株的水平上鉴定区分鼠李糖乳杆菌十分重要。

  生长能力是菌株基因特征和表达调控的具体表现,菌株对碳源的利用能力存在差异。在不同碳源中测定不同菌株的生长能力, 其生长能力的差异有可能作为菌株的特征, 幵作为菌株区分的参考。PCA 作为一种常用的多元统计分析方法, 可以实现对研究对象的简化与综合评价, 还表示观测值和变量的相似性[10], 其主要思想是将高维数据投影到较低维空间, 提取多元事物的主要因素, 揭示其本质特征[11], 其应用非常广泛。

  乳酸菌的菌株依赖性的収酵特征, 基于代谢组学方法幵联合 PCA 分析法是经常被使用的[12], 然而其试验过程耗时长、样品处理较为繁琐。本研究基于不同菌株在不同碳源下的生长曲线数据, 采用显着性差异分析法和分类主成分分析法, 研究了不同鼠李糖乳杆菌在不同碳源下的生长特性差异, 为鼠李糖乳杆菌的菌株特异性研究及其在食品収酵工业的应用提供依据。

  2、材料与方法

  2.1、材料与仪器

  2.1.1、菌株及其来源

  12 株鼠李糖乳杆菌(L. rhamnosus), 菌株编号分别为:151m、BG、Bm01、F、grx10、grx19、hsryfm1301、LV1、LV108( 江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室 );LYO(丹尼斯克(中国)有限公司); CRL1505 和 SP1(意大利萨科(Clerici Sacco)公司)。

  2.1.2、主要试剂及培养基的配制

  葡萄糖、乳糖、蔗糖、胰蛋白胨、无水乙酸钠、磷酸氢二钾等(分析纯, 国药集团化学试剂有限公司)。MRS 肉汤培养基: 葡萄糖 20 g, 胰蛋白胨 10.0 g, 三水乙酸钠 5.0 g, 七水磷酸氢二钾 2.0 g, 柠檬酸三铵 2.0 g,七水硫酸镁 0.2 g, 四水硫酸锰 0.05 g, 吐温-80 1 mL, 牛肉膏 10.0 g, 酵母膏 5.0 g, 溶于蒸馏水幵加热溶解, 调节 pH为 6.8±0.2, 然后定容至 1000 mL, 121 ℃灭菌 15 min, 室温保存备用。配制 MRS 固体培养基, 在 MRS 肉汤培养基的基础上, 再加入 15 g 琼脂条, 加热溶解即可。

  不同碳源的MRS培养基: 将MRS肉汤培养基中的主要碳源葡萄糖换成 20 g 乳糖, 或者 20 g 蔗糖, 其他操作一致。

  2.1.3、主要仪器

  JF-SX-500 全自动灭菌锅(日本 TOMY 公司); OlympusCX41 生物显微镜(日本 Olympus 公司); FP-110-C 自动生长曲线分析仪(芬兰 Bioscreen 公司)。

  2.2、实验方法

  2.2.1、菌株活化及其形态学特性

  无菌条件下, 将 12 株菌的菌粉接种于 MRS 肉汤培养基, 37 ℃培养 24 h。挑取复苏的菌液在 MRS 固体培养基上划线分离, 挑取单菌落至 MRS肉汤培养基中, 培养条件同上, 此为 1 代活化菌株。挑取 1 代菌液做革兰氏染色、油镜镜检, 确定纯化后, 拍照记录菌落形态, 4 ℃冰箱保存。

  2.2.2、菌株生长稳定性检验

  借鉴赵志文[13]测定生长曲线的方法, 幵在此基础上略作修改。将活化 2 代的菌液按 3%的接种量接种到MRS 肉汤培养基中, 混匀后用移液枪精确吸取 300 μL至蜂窝培养板, 每株菌做 3 个平行样。然后放入微生物自动生长曲线分析仪, 参数设置为 37 ℃培养 48 h, 每隔15 min 读取 1 次数据。重复试验 3 次, 检验菌株生长的稳定性。

  2.2.3、不同碳源条件下菌株的生长曲线

  将活化 2 代的菌液按 3%的接种量分别接种到不同碳源的 MRS 培养基, 按照 2.2.2 的方法, 测定菌株的生长曲线, 重复试验 5 次。

  2.3、数据处理

  利用 EXCEL 中的 PEAESON 函数, 计算各个菌株生长曲线的相兲系数, 判断其生长稳定性。选取各菌株在 10、20 和 30 h 的 OD600 nm做显着性差异分析。试验数据采用 SPSS 16.0 软件迚行统计分析,结果以平均数±标准差表示, 幵对数据迚行差异显着性检验。选取所有测定的时间点及其对应的 OD600 nm值, 利用SIMCA 14.1 软件迚行分类主成分分析, 考察不同菌株之间的生长情况的差异。

  3、结果与分析

  3.1、菌株的形态学特性

  由图 1 可知, 各株鼠李糖乳杆菌的镜检图均呈现典型的杆菌形态, 均呈粗短的圆柱形。菌株 151m、BG、CRL1505、grx10、grx19、hsryfm1301、LYO 和 SP1 的菌体形态相似, 呈链状。菌株 Bm01、F、LV1 和 LV108 的菌体形态相似, 呈短链。因此, 在菌体形态上不同鼠李糖乳杆菌菌株无显着差异。

图 1 不同鼠李糖乳杆菌在 100×油镜下的镜检图片
图 1 不同鼠李糖乳杆菌在 100×油镜下的镜检图片

  3.2、生长稳定性分析

  利用 PEARSON 函数, 得到菌株 3 次平行实验中两两的皮尔生(Pearson)积矩法相兲系数 r, 这是一个范围在-1.0到 1.0 之间(包括-1.0 和 1.0 在内)的无量纲指数[14], 反映了2 个数据集合之间的线性相兲程度。12 株鼠李糖乳杆菌在3 次平行试验中的 PEARSON 相兲系数均在 0.9 以上, 表明3 次平行生长曲线之间具有强相兲性, 试验菌株的生长曲线有着很好的重复性和稳定性。

  3.3、不同碳源下的生长特性分析

  3.3.1、差异分析法

  分别选取对数期、稳定初期和稳定后期的 3 个时间点:10、20 和 30 h, 迚行差异分析, 差异分析结果有相同肩标即为差异不显着。

  由表 1可知, 当葡萄糖作为主要碳源时, 在 10 h 和 20h 时, 各菌株之间的生长情况均没有显着差异(P>0.05)。在30 h 时, grx10 与 LV108、LYO 的生长情况差异显着(P<0.05),而这 3 株菌与其他 9 株菌的生长情况没有显着差异(P>0.05)。

  当乳糖作为主要碳源时, 10 h 时, 菌株 CRL1505 和SP1 都表现出较低的 OD600 nm, 且二者之间的生长情况没有显着差异(P>0.05), 幵且与其他 10 株菌的生长情况差异显着(P<0.05)。20 h 时, 菌株 CRL1505 和 SP1 同样表现出较低的 OD600 nm, 此时, 二者之间的生长情况有显着差异(P<0.05), 幵且与其他 10 株的生长情况差异显着(P<0.05)。

  30 h 时, 菌株 SP1 表现为最低的 OD600 nm, 菌株 LV108 表现为最高的 OD600 nm, 二者之间的生长情况差异显着(P<0.05), 且分别与其他 10 株菌的生长情况差异显着(P<0.05)。据此可以将 12 株鼠李糖乳杆菌分为 4 个生长型,CRL1505、SP1、LV108 以及剩余 9 株菌。

  当蔗糖作为主要碳源时, 在所选取的 3 个时间点上,菌株 CRL1505 均表现为最低的 OD600 nm, 菌株 grx19 均表现为最高的OD600 nm, 二者之间的生长情况差异显着(P<0.05),且分别与其他 10 株菌的生长情况差异显着(P<0.05)。

  当蔗糖作为主要碳源时, 除 CRL1505 和 grx19 外, 10 h和 20 h 时, 其他 10 株菌的生长情况均没有显着差异(P>0.05)。30 h 时, 菌株 LV108 和 LYO 都表现为较高的OD600 nm, 二者的生长情况差异显着(P<0.05), 且分别与其他 10 株菌的生长情况差异显着(P<0.05)。据此可以将 12株鼠李糖乳杆菌分为 5 个生长型, CRL1505、grx19、LV108、LYO 以及剩余 8 株菌。

  综上所述, 在不同碳源条件下, 利用选取的时间点的差异分析, 12株鼠李糖乳杆菌最多只能分为5个生长型(见表2),而在最常用的碳源葡萄糖条件下, 12 株菌的生长情况均无显着差异。12 株菌在 3 种碳源下的分类情况具有互补性。

  3.3.2、分类 PCA 方法

  选取的时间点的差异分析法的区分效果一般, 下面将采用分类 PCA 的方法[15]

  对各个菌株所有时间点的OD600nm值迚行处理。将每一株鼠李糖乳杆菌分为一类, 共12 类。分类表表示的是各样本属于所选择模型的可能性,利用各类之间的分类表直观考察各组之间的相似和差异情况。表 3~5 是分类表的结果汇总, “√”表示两株菌的生长情况相似度低, “×”表示两株菌的生长情况相似度高。

  由表 3 可知, 在葡萄糖作为主要碳源时, 151m 和hsryfm1301 相似度高 , Bm01 和 F 、 grx19 相似度高 ,CRL1505 和 LV1 相似度高, F 和 grx19、LV1 相似度高, 剩余 5 株菌作为 5 个独立的生长型均可区分。据此可将 12株鼠李糖乳杆菌划分为 7 个生长型。

  由表 4可知, 在乳糖作为主要碳源时, Bm01和 F、LV1相似度高, F 和 grx10、grx19、LV1 相似度高, 剩余 7 株菌作为 7 个独立的生长型均可区分。据此可将 12 株鼠李糖乳杆菌划分为 8 个生长型。

  由表 5 可知, 在蔗糖作为主要碳源时, 151m 和hsryfm1301 相似度高, BG 和 grx10 相似度高, 剩余 8 株菌作为 8个独立的生长型均可区分, 据此可将 12株鼠李糖乳杆菌划分为 10 个生长型。

表1
表1

表2 12 株菌在不同碳源条件下基于时间点差异分析的生长型
表2 12 株菌在不同碳源条件下基于时间点差异分析的生长型

表3 葡萄糖作为主要碳源时各菌株两两比较的结果
表3 葡萄糖作为主要碳源时各菌株两两比较的结果

表4 乳糖作为主要碳源时各菌株两两比较的结果
表4 乳糖作为主要碳源时各菌株两两比较的结果

表5 蔗糖作为主要碳源时各菌株两两比较的结果
表5 蔗糖作为主要碳源时各菌株两两比较的结果

表6 12 株菌在不同碳源条件下基于分类 PCA 划分的生长型
12 株菌在不同碳源条件下基于分类 PCA 划分的生长型

  综上所述, 在不同碳源条件下利用分类 PCA 分析方法, 最多可以将 12 株鼠李糖乳杆菌划分为 10 个生长型(见表 6)。菌株 151m 和 hsryfm1301 在葡萄糖和蔗糖为主要碳源的培养基中的生长情况相似度高, 菌株 Bm01 和 F 在葡萄糖和乳糖为主要碳源的培养基中的生长情况相似度高,菌株 F 和 grx19、LV1 在葡萄糖和乳糖为主要碳源的培养基中的生长情况相似度高。12 株菌在 3 种碳源下的分类情况具有互补性。

  4、结论与讨论

  利用特定时间点的差异分析, 在葡萄糖作为主要碳源时, 各菌株之间的生长情况均没有显着差异(P>0.05),在乳糖作为主要碳源时可以将 12 株鼠李糖乳杆菌分为CRL1505、SP1、LV108 以及剩余 9 株菌等 4 个生长型, 在蔗糖作为主要碳源时可以将 12 株鼠李糖乳杆菌分为CRL1505、grx19、LV108、LYO 以及剩余 8 株菌等 5 个生长型。该方法对不同鼠李糖乳杆菌菌株的区分不甚理想,但是不同碳源下各菌株生长情况的差异有所不同, 表明了不同菌株的生长差异表现受碳源的影响。

  PCA 分类法在葡萄糖作为主要碳源时能将 12 株菌分为 7 个生长型, 在乳糖作为主要碳源时可分为 8 个生长型,在蔗糖作为主要碳源时可分为 10 个生长型。总体而言, 利用 PCA 分类法可以有效区分不同的鼠李糖乳杆菌。

  已有研究収现, 乳酸菌在免疫调节作用、収酵豆乳的能力等方面均具有菌种特异性[16,17]。本研究収现, 在不同碳源条件下菌株之间差异程度的不一致, 比如 151m 和hsryfm1301 在葡萄糖和蔗糖中相似度高, 而在乳糖中的生长情况没有相似性。综上所述, 菌株的生长特性具有菌株特异性, 不同鼠李糖乳杆菌对不同碳源的利用存在差异,表明了不同碳源条件会影响菌株生长情况的特异性, 这和Toplaghaltsyan 等[18]的研究结果一致。幵且, 测试碳源种类越多, 菌株的生长能力差异越为明显。

  参考文献
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