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彝药大火草花中槲皮素的色谱定性研究

作者:原创论文网 时间:2017-08-02 11:15 加入收藏
  摘要:目的建立大火草花中槲皮素的提取方法,对大火草花中槲皮素进行薄层和高效液相方法鉴别。方法采用薄层色谱法对大火草花中槲皮素进行分离鉴别,并用高效液相色谱法加以确定。结果大火草花中含槲皮素成分,可用薄层色谱鉴别槲皮素。结论薄层色谱法简便、准确,高效液相色谱法可为槲皮素含量的测定奠定基础。
  
  关键词:大火草花;槲皮素;薄层色谱法;高效液相色谱法 .
  
  大火草记载于《云南省中药材标准》2005版第六册彝族药(Ⅲ)。为菊科植物钩苞大丁草Gerbera delavayi France的干燥全草。又名钩苞大丁草、小一支箭、火草、白地紫苑等,是一种民间常用中药。具有清热利湿,消积杀虫等作用。临床主要用于治疗痢疾,胃痛,消化不良,蛔虫症等。槲皮素,又名栎精,槲皮黄素,可作为药品,具有较好的祛痰、止咳作用,并有一定的平喘作用。此外还有降低血压、增强毛细血管抵抗力、减少毛细血管脆性、降血脂、扩张冠状动脉,增加冠脉血流量等作用。用于治疗慢性支气管炎。对冠心病及高血压患者也有辅助治疗作用。此外,邢博士关于《利用槲皮素阻断雄激素对激素依赖型的人类前列腺癌细胞的发现》一文认为,槲皮素可以阻断雄激素对激素依赖型的人类前列腺癌细胞的作用。本文采用薄层色谱法和高效液相色谱法,对大火草花中有效成分槲皮素进行了研究,对其质量控制有一定的意义。
  
  1仪器和材料 .
  
  大火草(玉溪市澄江县帽天山自采);槲皮素对照品(中国食品药品检定研究院,批号:100081-201408 含量以991%计);电子天平(赛多利斯BP211D-OCE,赛多利斯BSA224S-CW);高效液相色谱仪(安捷伦1260);超声清洗仪(Branson 5800);硅胶G薄层色谱板(MERCK HX117107);可见-紫外分光光度计(安捷伦Cary 60);薄层色谱板成像仪(Biostep Cabuvis);数显控温水浴锅(XMT-DA);电热加热板(EH20A-plus);水处理器(Micra operator manual);自动显色喷射器(SPU-1);玻璃仪器均为天津玻璃仪器厂生产;分析纯试剂均为四川西陇化工有限公司生产,色谱纯甲醇为德国默克股份有限公司生产。
  
  2方法与结果 .
  
  2.1薄层鉴别 .
  
  2.1.1供试品溶液的制备取供试品粉末01 g,加70%乙醇30 mL超声30 min,取滤液蒸干,加水10 mL使溶解,用石油醚(30~60℃)萃取,弃去石油醚液,水溶液加3 mL稀盐酸回流1小时,用冷水立即冷凝,用乙酸乙酯萃取3次,每次10 mL,合并乙酸乙酯提取液,蒸干,加1 mL乙酸乙酯溶解,作为供试品溶液。
  
  2.1.2对照品溶液的制备取槲皮素对照品适量,加甲醇制成每1 mL含1 mg槲皮素的溶液,作为对照品溶液。
  
  2.1.3色谱方法照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部 通则 0502)试验,分别吸取上诉两种溶液,分别点于同一硅胶G薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(10:8:1)为展开剂展开,取出,晾干,喷以三氯化铝试液,在日光和紫外(365 nm)下检视。
  
  2.1.4结果供试品色谱在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点和荧光斑点。TLC色谱图见图1.
  
  2.2HPLC测定 .
  
  2.2.1HPLC鉴别吸收波长的确定取槲皮素对照品适量,加甲醇制成每1 mL含5 ug槲皮素的溶液,作为供试品溶液,以甲醇为空白溶液,取供试品溶液,在200~800 nm波长范围内进行扫描,结果在375 nm和255 nm处有最大吸收。375 nm波长处峰形状圆滑对称,故选择375 nm为HPLC鉴别吸收波长。见图2、图3:
  
  2.2.2色谱条件色谱柱为ZORBAX Extend-C18(46 mm×250 mm,5 um);流动相为甲醇-02%磷酸(45:55);流速10 mL/min.检测波长375 nm,柱温30℃。进样量10 uL.理论塔板数按槲皮素计算,应不低于 6000.在此色谱条件下,槲皮素对照品和大火草火药材的HPLC图谱见图4、图5.
  
  2.2.3对照品溶液的制备取槲皮素对照品适量,加甲醇制成每1 mL含50 ug槲皮素的溶液,作为对照品溶液。
  
  2.2.4供试品溶液的制备取本品粉末01 g,精密称定,精密加甲醇-25%盐酸(4:1)25 mL,称重,回流提取1 h,冷却,补足重量,过滤,精密吸取续滤液5 mL~25 mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,用微孔滤膜(045 um)滤过,取续滤液,即得供试品溶液。
  
  2.2.5结果供试品色谱在与槲皮素对照品色谱相同的保留时间上有相同峰。见图4、图5.
  
  3讨论 .
  
  3.1薄层鉴别提取方法比较本实验尝试了多种提取方法:①以甲醇为溶剂回流提取60 min,滤过,滤液浓缩。②以乙醇为溶剂超声处理60 min,滤过,滤液浓缩。③以70%乙醇超声30 min,取滤液蒸干,加水使溶解,用石油醚(30~60℃)萃取,弃去石油醚液,水溶液加l稀盐酸回流1 h,用冷水立即冷凝,用乙酸乙酯萃取3次,合并乙酸乙酯提取液,蒸干,残渣加乙酸乙酯溶解。比较上诉三种方法,以方法③所得色谱图斑点比较清晰圆整,且色素斑点较少。
  
  3.2薄层鉴别展开剂的比较实验用不同展开剂展开,对结果进行比较:①以石油醚(60℃~90℃):丙酮(5:1)为展开剂,紫外365 nm下观察。②正己烷:乙酸乙酯:甲酸(7:5:08)为展开剂,紫外365 nm下观察。③甲苯:乙酸乙酯:甲酸(10:8:1)为展开剂,紫外365 nm下观察,喷以三氯化铝试液,在日光和紫外(365 nm)下观察。④氯仿:甲酸乙酯:甲酸(5:4:1)盐酸蒸汽饱和为展开剂,置紫外365 nm下观察。⑤乙酸乙酯:甲酸:水(8:1:1)为展开剂,喷以三氯化铝试液,在日光和紫外(365 nm)下观察。⑥以氯仿:甲醇(10:08)为展开剂,紫外365nm下观察。比较上述六种展开剂的展开结果,以方法③的分离效果和Rf值比较好。
  
  3.3薄层鉴别点样量的筛选本实验分别对供试品溶液2、5、10、15 uL的点样量进行筛选,结果如图6,表明以10 uL的点样量斑点在日光和紫外365 nm下表现均较好。
  
  3.4样品不同部位槲皮素薄层鉴别本实验对样品不同部位的槲皮素进行了薄层鉴别比较,结果表明花中槲皮素的含量最高,故选用样品的花进行试验研究。
  
  3.5大火草易于生长,在松树林下山坡草丛中都能生存。本方法操作简单,结果清晰明确。可为大火草的开发及槲皮素的来源提供一个依据,为今后大火草的质量控制提供参考。
  
  参考文献:
  
  [1]国家药典委员会中华人民共和国药典[S]北京:中国医药科技出版社,2015 . 
  [2]王祥培,许士娜,吴红梅,等天胡荽药材中槲皮素的薄层鉴别与含量测定[J],时珍国医国药2010,21(1):44 .  
  [3]俞一心,戈升荣,王桂珍,等槲皮素及其衍生物的药理作用研究进展[J],中药材,2003,26(12):902 .  
  [4]杨修镇甜地丁中槲皮素的薄层鉴别与含量测定,第五届中国兽药大会-动物药品学会分论文集[C] .  
  [5]云南省食品药品监督管理局云南省中药材标准·彝族药(Ⅲ)[S],昆明:云南科技出版社,2005.
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